دئوکسی ریبونوکلئیک اسید (Deoxyribonucleic Acid) یا DNA، ماده وراثتی تمام موجودات زنده، مولکولی است که حاوی اطلاعات لازم جهت ساخت پروتئین‌های همه سلول‌های یک موجود زنده می‌باشد. در این قسمت از سری مقالات هینا آکادمی با استخراج دی ان ای و شیوه‌های سنتی و مدرن موجود در این حوزه آشنا می‌شویم.
به فرآیندی که در آن DNA با استفاده از روش‌های مختلف از جمله روش‌های فیزیکی و شیمیایی، از داخل سلول جدا میشود، استخراج دی ان ای یا جداسازی دی ان ای گفته میشود.
روش‌های استخراج DNAدر دو دسته روش‌های سنتی و نوین قرار می‌گیرند.
روش‌های سنتی و قدیمی استخراج دی ان ای شامل دو ورش زیر می‌باشد:
این روش رایج‌ترین روش از دسته روش‌های سنتی می‌باشد. مراحل کلی این روش به شرح زیر است:
1- شکست دیواره سلولی
در این مرحله که از مهم‌ترین مراحل در این روش محسوب میشود، با استفاده از روش‌های مکانیکی، شیمیایی و آنزیمی دیواره سلولی شکسته میشود.
2- لیز کردن سلول‌ها
در این مرحله ابتدا به کمک بافرهایی که خاصیت لیز کنندگی دارند و حاوی دترجنت‌ها (مانند سدیم دودسیل سولفات)، نمک‌ها و بافرها هستند، غشای سلولی شکسته میشود و مولکول DNA و تمام آنچه درون سلول وجود دارد از جمله پروتئین‌ها، آر ان ا و لیپیدها رها میشود.
نقش دترجنت‌ها، دناتوره کردن پروتئین‌ها و حل کردن غشاهای لیپیدی می‌باشد و حفظ پایداری DNA، به کمک نمک‌ها انجام میشود.
3- افزودن ترکیب فنل-کلروفرم
در این مرحله با اضافه کردن ترکیب فنل و کلروفرم باعث میشود پروتئین‌ها دناتوره شوند و دو فاز به نام‌های فاز آبی که شامل DNA است و دیگری فاز آلی که شامل چربی‌ها و پروتئین‌ها هستند، تشکیل میشود.
در این مرحله فنل عامل دناتوره شدن پروتئین‌ها و رفتن آن‌ها به فاز آلی می‌باشد. افزایش جداسازی فازها از یکدیگر و همچنین حذف اضافات فنل از فاز آبی، به کمک کلروفرم انجام میشود.
4- انجام سانتریفیوژ
دو فاز آبی و آلی که در مرحله قبل ایجاد شده‌اند، با انجام عمل سانتریفیوژ از یکدیگر جدا سازی می‌شوند.
5- جمع کردن فاز آبی
همانطور که گفتیم فاز آبی دارای DNA و RNA می‌باشد که در این مرحله آن را جمع کرده و اتانول 70 درصد به آن می‌افزایند و در نتیجه از DNA یا RNA رسوبی حاصل میشود. (در این مرحله اگر حذف DNA و RNA مهم است، باید در ابتدا از آنزیم استفاده کنید).
6- شستشو دادن و خشک کردن رسوب DNA حاصل از مرحله قبل
در این مرحله توسط اتانول 70 درصد رسوب حاصله از DNA شسته شده و بعد عمل خشک کردن با استفاده از واکوئوم انجام میشود.
7- محلول سازی DNA در داخل بافر مناسب
در این مرحله DNA که در مرحله قبل خشک شده را برداشته و در یک بافر بهینه مثل
TE (Tris-EDTA) یا آب مقطر استریل حل می‌کنند.
ب) روش سالتینگ اوت (Salt Precipitation)
در این روش با استفاده از نمک‌هایی همچون سدیم پرکلرات، پروتئین‌ها و DNA را رسوب می‌دهند. در این روش هم DNA باید رسوب داده شود که با روش تغییر دادن غلظت نمک رسوب DNA اتفاق می‌افتد. مراحل کلی این روش در زیر آمده است:
1- لیز سلولی
در این مرحله برای جدا شدن DNA از روش‌های فیزیکی و یا شیمیایی بهره می‌گیرند و لیز سلولی اتفاق می‌افتد.
2- اضافه کردن نمک
در این مرحله با افزودن نمک‌هایی مانند سولفات آمونیوم به محلول دارای DNA، رسوب پروتئین‌ها اتفاق می‌افتد.
3- انجام سانتریفیوژ
در این مرحله با سانتریفیوژ کردن محلول حاصل از مرحله قبل، رسوب‌های پروتئینی از سایر بخش‌ها جدا می‌شوند.
4- رسوب دادن DNA
در این مرحله با افزودن الکل‌هایی مانند ایزوپروپانول، رسوب DNA حاصل میشود.
5- شستشو دادن
هدف از این مرحله از بین بردن نمک‌ها و ناخالصی‌های موجود می‌باشد که به کمک اتانول 70 درصد شستشو انجام میشود و ناخالصی‌ها حذف می‌شوند.
6- حل کردن DNA
در این مرحله با استفاده از بافرهایی مانند TE (Tris-EDTA) رسوب ایجاد شده از DNA حل میشود.
ساده، آسان و قابل اجرا بودن این روش‌ها حتی در آزمایشگاه‌های با لوازم و ابزارهای مختصر، از مزایای شیوه‌های سنتی استخراج DNA می‌باشد.
1- به کار گرفتن از ترکیبات شیمیایی مضر و خطرناک مثل فنل و کلروفرم
2- نیاز به زمان بیشتر برای انجام این روش‌ها
3- بیشتر بودن خطاهای انسانی در شیوه‌های سنتی
روش‌های مدرن دارای مزیت‌های بسیاری نسبت به شیوه‌های سنتی هستند. این روش‌ها با دقت و سرعت بالاتر فرآیند استخراج را انجام می‌دهند و همچنین کارایی و بازدهی بالاتری نسبت به روش‌های سنتی دارند. در ادامه به چند مورد از روش‌های مدرن استخراج DNA می‌پردازیم.
استفاده از ستون‌های سیلیکا از معمول‌ترین شیوه‌های نوین برای استخراج و جداسازی دی ان ای در روش‌های ستونی می‌باشد. در این روش مولکول DNA به دانه‌های سیلیکا متصل میشود و به کمک بافرهای گوناگون عمل شستشو انجام میشود و ناخالصی‌ها از بین می‌روند. در آخر هم با استفاده از یک بافر مناسب، DNA خالص شده از ستون سیلیکا رها میشود.
مزایای استفاده از ستون‌ها کروماتوگرافی برای استخراج دی ان ای
این روش‌ها جذب DNA را با استفاده از ذراتی با خاصیت مغناطیسی پوشش داده شده با سیلیکا انجام می‌دهند. در ادامه یک میدان مغناطیسی اعمال میشود و ذراتی که دارای DNA هستند، به کناره‌های لوله می‌چسبند و با شسته شدن ذرات ناخالصی فرآیند پایان می‌یابد.
مزایای روش‌های مغناطیسی
نتیجه‌گیری
در این مقاله از مقالات آموزشی سایت هیناآکادمی به بررسی انواع روش‌های سنتی و مدرن در حوزه استخراج دی ان ای پرداختیم. و همانطور که پیش‌ترگفتیم امروزه به دلیل معایبی که در روش‌های سنتی استخراج دی ان ای نسبت به شیوه‌های مدرن وجود دارد، کمتر از این روش‌ها استفاده میشود و شیوه‌های نوین جای روش‌های سنتی را گرفته‌اند. در روش‌های مدرن، دقت و سرعت بالاتر و بازدهی و کیفیت هم بهتر است. همچنین به لحاظ ایمنی روش‌های مدرن ایمن‌ترند.
سوالات متداول
1- استخراج DNA به چه معناست؟
به فرآیندی که در آن DNA با استفاده از روش‌های مختلف از جمله روش‌های فیزیکی و شیمیایی و توسط مواد مختلف، ازنمونه جدا میشود، استخراج DNA گفته میشود.
2- معایب شیو‌های سنتی استخراج دی ان ای نسبت به شیوه‌های جدید چه هستند؟
به کار گرفتن از ترکیبات شیمیایی مضر و خطرناک مثل فنل و کلروفرم
نیاز به زمان بیشتر برای انجام این روش‌ها
بیشتر بودن خطاهای انسانی در شیوه‌های سنتی
پایین بودن کارایی و راندمان این شیوه‌ها
3- مزایای استفاده از روش‌های مغناطیسی در جداسازی دی ان ای چیست؟
1- در این روش‌ها به دلیل بالا بودن سرعت و دقت، عمل استخراج دقیق و سریع انجام میشود.
2- این روش‌ها برای نمونه‌هایی که حجم زیادی ندارند و اندک هستند، مناسب و ایده‌آل می‌باشد.
30%
20%
25%
